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BCM-2501
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Envoyée par : Jonathan Poulin
Répondue par : Alexandre Viau
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2004-03-29
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Question
#107
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Bonjour,
Je ne comprend pas très bien comment fait-on pour mesurer la liaison spécifique d'un ligand a une récepteur ainsi que la signification du facteur Bmax...?
merci beaucoup |
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Réponse
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 Bonjour Jonathan,
J'ai fait une petite image pour que tout le monde puisse suivre.
Le principe expérimental pour trouver la liaison spécifique est le suivant. On prend des quantités croissantes d'un ligand chaud (radioactif) que l'on incube avec des membranes contenant une quantité de récepteurs constante. En regardant la quantité de radioactivité liée aux membranes après des périodes de lavages pour chaque point de concentration utilisée, cela nous permet de faire une courbe de la liaison totale de radioactivité liée en fonction de la concentration de ligand chaud.
Cette liaison représente la liaison spécifique au récepteur et la liaison non-spécifique soit aux autres protéines des membranes, soit à des sucres où lipides membranaires. En effet un ligand va toujours lier de manière non-spécifique la membrane.
Afin de se débarrasser de cette liaison non-spécifique et d'obtenir une courbe représentant la liaison spécifique du ligand, on utilise une technique simple. On incube les mêmes concentrations de ligand chaud avec les membranes, mais cette fois en présence d'un large excès du même ligand, mais froid (non-radioactif). De cette façon on bloque tous les récepteurs spécifiques avec les ligands froids en excès et la radioactivité qui reste liée après les lavages représente la liaison non-spécifique du ligand chaud aux protéines des membranes. En effet, les sites non-spécifiques, contrairement aux spécifiques, sont insaturables par un excès de ligand froid, car ils sont infinis sur la membrane. Donc la courbe en rouge sur le graphique représente la liaison non spécifique et elle est typiquement non expodentielle et augmente de façon linéaire avec la concentration de ligand chaud ajoutée.
Finalement grâce à ces deux courbes expérimentale (liaison totale en bleu et liaison non-spécifique en rouge) on peut CALCULER la liaison spécifique en soustrayant la valeur de la courbe rouge pour chaque point de la courbe bleu. Cette courbe est donc déduite des deux autres et non obtenue expérimentalement.
Cette courbe représentée en vert va maintenant atteindre un plateau, car l'augmentation linéaire du à la liaison non-spécifique est maintenant soustraite. Le plateau représente la situation ou tout les sites spécifiques (récepteurs) disponible sont liés à un ligand (saturé). On appelle ce point le Bmax. Donc avec ce facteur, on a une idée du nombre total de site spécifique sur nos membranes.
Finalement, puisque l'allure de la courbe nous donne un dernier paramètre appelé Kd, qui représente la constante de dissociation, ou si vous préférez l'afinité du ligand. En effet, plus le ligand va saturer les récepteurs à une faible concentration, plus il a une affinité grande pour le récepteur. Donc plus vite on atteint le plateau dans la liaison spécifique, plus on a un ligand de grande affinité. Pour avoir un paramètre simple pour décrire l'allure de la courbe, on détermine la concentration de ligand chaud nécessaire pour obtenir 50% de la liaison spécifique totale disponible (Bmax/2). Plus cette concentration est faible, plus le ligand a rempli les sites rapidement, donc plus il a de l'affinité pour le récepteur en question.
J'espère que ça vous aura aidé, mais vous pouvez toujours consulter vos notes sur WebCT qui sont assez complète sur le sujet.
Alex ;-0
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