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BCM-2501
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Envoyée par : Robert beausejour
Répondue par : Alexandre Viau
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2004-04-14
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Question
#116
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Comment fonctionne les contrôle pour la technique de retard sur gel...
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Réponse
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La technique de retardement sur gel sert à caractériser les sites de liaison spécifiques des protéines sur l’ADN ou à identifier des protéines liant une séquence donnée. Pour ce faire, une sonde radioactive marquée au 32P est préparée. Cette sonde est constituée généralement d’un bout d’ADN double brin qui contient une séquence d’intérêt (environ 15 à 30 paire de bases), mais elle peut aussi être simple-brin ou de l’ARN. La sonde est incubée pour une certaine période avec une protéine purifiée ou avec des extraits totaux ou nucléaires contenant les partenaires potentiels.
On sépare ensuite la sonde non-liée de la sonde liée grâce à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions non-dénaturantes. La position de la sonde dans le gel est révélée grâce à l’exposition du gel avec un film, afin de détecter l’émission de radioactivité par le 32P couplé à la sonde. La sonde libre migrera typiquement très vite dans le gel, car elle est très petite en comparaison à un complexe protéine/ADN. Donc en absence de protéines avec une interaction spécifique, on a une bande intense qui sort dans le bas du gel. Cependant, si une protéine lie spécifiquement la sonde, il y aura retardement d’une partie de la sonde dans le gel. De là l’expression « retardement sur gel ». Ainsi, la fraction de la sonde qui aura liée la protéine migrera moins vite, car elle est retardée par la taille de la protéine qui est encore capable d’interagir avec l’ADN dans le gel (gel non-dénaturant).
Maintenant voyons les contrôles possibles. Tout d’abord, si on ne met pas de protéines (1) toute la sonde migre vite. En ajoutant l’extrait, une partie de la sonde est retardée (2) à cause de sa liaison à une protéine X. Ensuite, si l’on ajoute à ce mélange la même sonde mais non marquée au 32P (froide), elle va compétitionner pour la liaison de la sonde marquée (chaude), ce qui devrait diminuer l’intensité de la bande de retardement (3). En effet, la protéine X va lier autant de sonde, mais elle ne fera pas la différence entre la sonde chaude ou froide. Cependant, seule la sonde chaude retardée peut être visualisée sur le film (radioactivité), donc on perd la bande de retardement si on utilise un excès de sonde froide « invisible ». Un contrôle intéressant pour s’assurer de la spécificité de liaison de notre sonde est d’utiliser une sonde froide en excès, mais où on a muté une ou quelques paires de bases du site de liaison spécifique. Ainsi, cette sonde froide ne devrait pas compétitionner pour la liaison à la protéine X, et donc ne devrait pas affecter le retardement sur gel (4).
Une deuxième série de contrôle souvent utilisée est l’utilisation d’anticorps spécifiques. En effet, si l’on ajoute à notre mélange un anticorps spécifique pour la protéine X, deux choses peuvent se passer. La première et la plus fréquente, est l’apparition d’un « super-shift », correspondant à une bande super-retardée (5). Cela s’explique par l’interaction de l’anticorps avec la protéine X sans affecter la liaison de la protéine X avec l’ADN. Ceci résulte en un plus gros complexe et donc en une migration moins rapide. La deuxième possibilité est que l’anticorps reconnaisse le domaine de liaison à l’ADN de la protéine X, l’empêchant le lier l’ADN (6). Cela va résulter en la disparition du retardement, étant donnée la compétition entre la liaison anticorps-protéine X et ADN-protéine X. Ces contrôle permettent de prouver que la protéine X est bien la protéine responsable du retardement sur gel, étant donné qu’un anticorps non-spécifique ne devrait pas avoir d’effet sur le retardement (il ne reconnaîtra pas la protéine X) (7).
J’espère que vous comprenez un peu mieux les contrôles du retardement sur gel, et n’oubliez pas que les contrôles sont souvent plus importants à comprendre que les résultats positifs, car ils sont la seule façon de valider nos résultats…
Si vous avez encore des doutes, envoyez vos questions!!
Alex ;-)
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