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BCM-2502
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Envoyée par : Long Nguyen
Répondue par : Marie-Claude Sincennes
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2004-09-09
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Question
#150
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J'aurais 2 questions.
Tout d'abord, comment les vecteur M13 (bactériophages M13) peuvent produire directement l'ADN simple brin servant de matrice pour le séquençage? Imaginons une origine f1 (M13) dans le vecteur.
Par ailleurs, comment des extrémités FRANCHES engendrées par la clivage des enzymes de restriction DIFFÉRENTS peuvent se recoller via l'utilisation de l'ADN ligase T4? Dans le cas des extrémités cohésives, on a montré qu'un fragment de restriction peut être inséré dans la coupure faite dans un vecteur via l'utilisation d'une MÊME enzyme de restriction.
Merci |
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Réponse
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Bonjour Long,
Je suis vraiment désolée de t'envoyer la réponse si tardivement. Cela ne se reproduira plus, je suis vraiment désolée.
Pour ta première question, il te faudra regarder le cycle de réplication des bactériophages, qui est bien expliqué dans le Voet p. 1030-1031, mais encore mieux dans le livre de Microbiologie de Prescott-Harley-Klein qui présente tout un chapitre sur les bactériophages. Le bacériophage M13 est un phage à ADN simple brin. Lors de la réplication de M13, la polymérase reconnaît l'origine de réplication dans l'ADN du phage. Si ce même site se trouve sur ton vecteur, la polymérase ne fera pas de différence et répliquera le vecteur de la même façon que pour l'ADN du phage. En surinfectant par ce bactériophage, on peut obtenir une grande quantité de notre plasmide sous la forme simple brin, pour permettre l'hybridation de l'amorce pour le séquençage. Une autre façon d'obtenir l'ADN simple brin, si notre vecteur ne contient pas d'origine pour M13, est de dénaturer l'ADN. Cette méthode est toutefois moins efficace car une partie de l'ADN peut se réhybrider. J'espère que cela t'éclaire un peu sur les vecteurs M13!
Pour ta deuxième question, eh bien tu dois voir les fragments d'ADN comme les pièces d'un casse-tête. Si l'extrémité de la pièce de casse-tête a une forme spéciale, elle ne peut que s'apparier avec la pièce qui a une forme complémentaire. Si par contre la pièce a un côté droit, alors tu peux la coller à n'importe quelle autre pièce qui a aussi un côté droit. Quand tu coupes l'ADN et que tu formes un bout cohésif, il ne pourra que s'apparier avec un brin qui lui est complémentaire (A+T, G+C). Par contre, quand tu as des extrémités franches, ces extrémités contiennent des nucléotides qui sont déjà appariés ensemble. Un bout franc n'a aucune extrémité simple brin, il peut donc être lié à n'importe quel autre brin avec des extrémités franches. Voici quelques exemples:
ATGCATCGTGTGCA peut se coller à TGTTACAGCATTACAG
TACGTAGCA CACGTACAATGTCGTAATGTC
car les deux bouts d'ADN simple brin sont complémentaires. Par contre, ce même fragment
ATGCATCGTGTGCA ne peut se coller à TTGCGCAATGGTCACCAGTGCTCA
TACGTAGCA TTGAAAACGCGTTACCAGTGGTCACGAGT
Le fragment suivant:
GTGCGTGCATGTTGCA peut se coller à CCGTGCA ou à TGGTCACGT
CACGCACGTACAACGT GGCACGT ACCAGTGCA
On dit qu'un fragment de restriction peut être inséré dans la coupure faite par l'utilisation d'une même enzyme de restriction. C'est vrai mais ce n'est pas complet. Je dirais plutôt ceci: un fragment de restriction peut être inséré dans la coupure faite par une enzyme de restriction qui génère un fragment complémentaire au premier, qu'il s'agisse ou non de la même enzyme. Dans le cas de deux bouts francs, ils seront toujours complémentaires, que l'enzyme utilisée soit la même ou non.
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