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BCM-2502
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Envoyée par : Frédéric Ouellet
Répondue par : Marie-Claude Sincennes
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2004-10-05
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Question
#160
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Lorsque l'on synthétise l'ADNc, et que l'on combine l'amorce oligo dT et les amorces aléatoires, les combine-t'on successivement ou simultanément?
Aussi, qu'arrive-t'il lors de la transcription si un brin est lié à plus d'une amorce (oligo dT et/ou aléatoire)? |
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Réponse
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Bonjour Frédéric,
Lorsque l'on synthétise l'ADNc, on peut utiliser l'oligo dT seul, les amorces aléatoires seules ou les deux en combinaison.
Avant de t'expliquer les différences, il est important que tu comprennes que la réverse transcriptase commence sa réction là où l'amorce se situe, mais qu'elle ne se termine pas toujours à un même endroit. La réverse transcriptase (RT) se détache de l'ARN après un certain temps qui varie à chaque réaction de transcription. L'enzyme peut faire un long brin de cDNA lors de la première réaction, suivi d'un brin extra-court, suivi d'un brin moyen, etc, et ce en partant de la même amorce. Donc si tu fais une réaction de réverse ransciptase, tu obtiens des brins de plein de tailles différentes.
Si l'on utilise l'oligo dT, on obtient des cDNA plus longs, car l'amorce s'hybride à l'extrémité de l'ARN. L'inconvénient de l'oligo dT, c'est que puisqu'il s'hybride en 3' seulement, les cDNAs obtenus représenteront principalement la partie 3' de ton ARN, et la partie 5' sera sous-représentée, puisque la réverse transcriptase ne se rend pas toujours à la fin de ton ARN.
Si l'on utilise les amorces aléatoires, alors les brins seront plus courts, car plusieurs amorces peuvent s'hybrider sur le même ARN. La réverse transciptase se lie sur une de ces amorces et fait la réaction jusqu'à ce qu'elle se frappe sur un autre duplex ADN/ARN, alors elle se détache et termine la réaction. Par contre, en utilisant les amorces aléatoires, on obtient une représentation plus répartie des séquences en 5’ et en 3’ du gène.
Quand on utilise les amorces aléatoires en combinaison avec les oligos dT, généralement on les combine simultanément, mais il serait possible de les combiner successivement selon le résultat désiré. Si ton brin d'ARN est lié à plusieurs amorces, ce n'est pas grave! L'enzyme reconnaîtra l'une ou l'autre de ces amorces et commencera la réaction à partir de cette amorce, et s'arrêtera quand elle frappera une autre amorce. On obtient donc des fragments plus courts que si on utilisait seulement l'oligo dT.
Rien de tel qu'un schéma pour illustrer ce que j'essaie de 'expliquer, mais je n'en ai pas trouvé aucun de satisfaisant, alors j'en ai fait un moi-même (en majuscules on voit les amorces, en minuscules on voit le cDNA synthétisé par l'enzyme):
dT:
gcggcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcggcgcgcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
<----------------------- cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgttttTTTTTTTTTTTTTTTTT
random:
gcuuuugcagacccauagaucacaggccauagacccgauuugacccauaggaucccaaaaaaaaaaaaaaa
<---------- tatcta gtgtcCGGTAT <------aaactgggTATCCT
random + dT:
gacucgaccugauuggcgcucgacagguacaguagaccggucgacagcuagcaggugaaaaaaaaaaaaaaaa
<-------ggactaaccgcGAGCTG <------ catctggccAGCTG <----- tccacttTTTTTTTTTTTTTT
Tu vois rapidement que plus on a d'amorces, plus les fragments de cDNA seront petits. On voit aussi qu'avec le dT, il y a moins de chances que la séquence du début soit transcrite par rapport au random...
J'espère que je ne t'ai pas mélangé!
Bonne chance!
Marie-Claude
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