|
BCM-3514
|
Envoyée par : Ape Karen
Répondue par : Jean-Sébastien Parent
|
2007-02-12
|
Question
#426
|
Bonjour, est-ce que vous pouvez m'expliquer en detaille la technique d'extension par amorce et son difference par rapport a 5'Race. Merci |
|
Réponse
|
Salut. La technique d’extension d’amorce est réalisée pour découvrir le site d’initiation de la transcription d’un gène dont la séquence est déjà connue. Le matériel de départ consiste simplement en un extrait d’ARN (contenant l’ARNm étudié) ainsi qu’une amorce radioactive. La séquence de l’amorce est choisie pour être complémentaire à une région le plus en 5’ du gène pour pouvoir rejoindre le site d’initiation de la transcription avec la réaction de polymérisation. C’est la réverse transcriptase qui ajoute les nucléotides à la suite de l’amorce en utilisant l’ARNm comme matrice. Cette réaction est illustrée à la diapositive 56. On retrouve donc un morceau d’ADN simple brin et radioactif qui peut être visualisé sur un gel dénaturant. On voit à la diapositive 58 l’exemple d’un gène qui possède deux sites d’initiation, illustrés par les deux bandes. Il ne faut pas oublier qu’un même gène peut avoir plusieurs sites d’initiation et cette technique permettra de tous les détecter et de façon quantitative (les uns par rapport aux autres). Il est alors possible d’évaluer l’emplacement du(des) site(s) d’initiation grâce à la taille du(des) brin(s) synthétisé(s). Dans l’exemple, les brins sont de 140 et 147 nucléotides, donc si l’amorce était longue de 20 nucléotides, le premier site est situé à 120 nucléotides de la fin de l’amorce et l’autre à 127 nucléotides.
La technique 5’ RACE est différente et nécessite un peu plus de travail. L’amorce utilisée dans ce cas n’a pas besoin d’être radioactive puisque le fragment sera cloné. Après la synthèse du premier brin d’ADN par la réverse transcriptase (comme plus haut), on utilise un enzyme particulier, la transférase terminale, pour allonger le brin de plusieurs adénines. Il est alors possible d’utiliser une deuxième amorce, une poly-thymine, pour amplifier un fragment double brin par PCR (deux amorces sont absolument requise pour ce type de réaction). Le produit du PCR peut alors être cloné dans un vecteur bactérien qui servira au séquençage du fragment. Le produit de la ligation entre le fragment double brin et le vecteur est utilisé pour transformer des bactéries. Les différents produits résultant de plusieurs sites d’initiation seront tous clonés plus ou moins également (perte de l'aspect quantitatif). Nous pourrons alors connaître la séquence précise de l’extrémité 5’ de l’ARNm et donc le site d’initiation de la transcription. Désolé pour le retard!
|
| Informations |
Question consultée 9839 fois. | 5387 votes, Moyenne 3/5.0 | À vous de voter => min      max |
|
Étudiants
