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BCM-3514
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Envoyée par : Guillaume Sylvain-Drolet
Répondue par : Franck Gallardo
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2008-02-04
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Question
#473
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Bonjour,
Je ne comprends pas les diapos 67 et 68. Il est question d'identification de facteurs de transcription liant des séquences promotrices. Il y a une représentation d'un retard sur gel et une sonde radioactive. Pourquoi?
La sonde lie quoi? Je crois qu'elle lie l'ADN et que lorsque les facteurs de transcription (extrait nucléaire) sont là, les facteurs bloquent l'ADN et empêchent la sonde de lier. Mais ce n'est pas ce qui est montré, il n'y a pas de liaison de la sonde en absence d'extrait nucléaire et en présence, la sonde lie l'ADN.
Bref, pouvez-vous m'éclairer sur ces diapos, pourquoi y a-t-il une sonde radioactive dans une expérience de retard sur gel? Lie-t-elle les facteurs de transcription?
Merci |
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Réponse
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Bonjour,
Les sondes radioactives utilisées dans ce type d’experience sont générées in vitro par PCR ou Nick translation en général.
La sonde radioactive générée correspond au site actif du promoteur étudié. Sur la diapo 67, on voit le résultat d’un gel retard avec la sonde radioactive correspondante et un extrait nucléaire contenant les protéines interagissant avec ce promoteur. Au puit 1, on peut voir uniquement le signal produit par la sonde migrant à une certaine taille. Quand on ajoute l’extrait nucléaire, on peut voir que plusieurs bandes apparaissent, ces bandes correspondent à la liaison d’une protéine sur la sonde radioactive correspondant au promoteur. On peut voir que la fixation de différentes protéines va induire des retards de migration différents, on appelle ceci un band shift. La ligne 3 correspond à une expérience de compétition avec une sonde non-marquée. La sonde non-marquée est présente en grande quantité et va titrer les protéines liant le promoteur. On peut donc voir que les band shift disparaissent. Ce puit montre que l’expérience est spécifique. Dans le puit 4, on peut voir que la compétition avec la sonde mutée va induire une perte de liaison du facteur 2 uniquement. Cette expérience indiquerait que le facteur 2 est également capable de se lier au site muté et que les facteurs 1 et 3 sont spécifiques de la sonde WT.
Pour la diapo 68, on identifie quelle protéine est liée a la sonde radioactive en utilisant un anticorps spécifique. On peut voir que le facteur X se lie bien a la sonde dans le puit 3 et que la bande produite par le facteur X est très retardée lors de l’ajout d’un anticorps, puit 4. La présence d’un super-shift est donc induite par la liaison de l’anticorps au facteur X. le facteur X se liant à l’ADN est donc identifié.
Voila, bonne continuation.
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